Отбор проб кормов и кормовых добавок
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО
ОБРАЗОВАНИЯ
«ОМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ
______________________________________________________________________
Кафедра ветеринарно-санитарной экспертизы продуктов животного происхождения и гигиены сельскохозяйственных животных
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
К лабораторным занятиям по дисциплине «Ветеринарно-санитарная экспертиза и гигиена воды, кормов и кормовых добавок»
Тема: «Отбор проб и органолептический анализ кормов. Исследование кормов на безвредность, загрязненность гельминтозами и амбарными вредителями».
Для подготовки студентов по специальности-110501
– ветеринарно-санитарная экспертиза
и бакалавров – направление-110500
– ветеринарно-санитарная экспертиза
Рекомендованы методической комиссией специальности – 110501
ветеринарного факультета ИВМ ОмГАУ
ОМСК 2010
Автор:
к.в.н., доцент К.В. Порошин
Ответственный за выпуск: д.б.н., профессор, зав. кафедрой ветеринарно-санитарной экспертизы продуктов животного происхождения и гигиены сельскохозяйственных животных М.В. Заболотных.
Рецензент:
1. В.И. Плешакова д.в.н., профессор, зав. кафедрой микробиологии и вирусологии ИВМ ОмГАУ.
Содержание
1. ОТБОР ПРОБ И ОРГАНОЛЕПТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КОРМОВ……4
1.1. Отбор проб кормов…………………………………………………………..4
1.2. Органолептический анализ кормов.…………………………………..……9
2. ИССЛЕДОВАНИЕ КОРМОВ НА БЕЗВРЕДНОСТЬ…………..………11
2.1. Определение токсичности и токсигенности на цыплятах………….…….13
2.2. Определение аллергенности на инфузориях………………………………14
2.3. Определение морфогенности на инфузориях……………………………..14
2.4. Определение эмбриотоксичности и тератогенности
на куриных эмбрионах……………………………………………….…….14
АНАЛИЗ КОРМОВ НА ЗАРАЖЕННОСТЬ ГЕЛЬМИНТАМИ
И АМБАРНЫМИ ВРЕДИТЕЛЯМИ…………………………………….…..15
3.1. Гельминтологические исследования………………………………………15
3.2. Виды амбарных вредителей…………………………………………..……16
3.3. Определение зараженности и поврежденности зерна
амбарными вредителями………………………………………………………..18
4. ЗАДАНИЯ…………………………………………………………….…..…..20
5. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ…………………………………………….20
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………20
ОТБОР ПРОБ И ОРГАНОЛЕПТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КОРМОВ
Отбор проб кормов
Отбор проб кормов проводят с участием ветеринарных и зоотехнических специалистов и представителя администрации хозяйств и предприятий, а в конфликтных случаях – с представителями организации-поставщика и местных органов Россельхознадзора.
В зависимости от назначения отобранные образцы подразделяют на точечные (разовые), средние и объединенные.
Разовая, или точечная, проба – проба, отобранная с одного места (точки). Точечные пробы берут из разных мест небольшими порциями, объединяя их в общую объединенную пробу, которую тщательно перемешивают и для отправки в лабораторию готовят среднюю пробу.
В том случае, когда отбор проб кормов осуществляют с целью постановки диагноза на заболевание или присутствие микотоксинов и фитотоксинов, проводят отбор ядовитых растений или наиболее пораженных плесенью участков.
Зеленые корма. Пробы зеленых кормов отбирают с пастбищ, лугов, участков кормовых культур в том случае, если зеленая масса предназначается непосредственно скармливанию животным, а также при подозрении на отравление ядовитыми растениями, нитратами, остатками пестицидов. Отбор проб проводят не менее тем с 10 точек участка. Точечные пробы тщательно перемешивают, расстилают ровным слоем и небольшими пучками, затем пробы объединяют и отбирают средний образец массой 1 кг, после этого вместе с этикеткой помещают в марлевые мешочки.
На сенокосах образцы берут с каждого укоса. Для этого на каждом участке выделяют не менее 10 делянок площадью 1-2 м2. Скашивают на них траву на высоту 5 см от земли. Отбор точечных проб проводят в сухую погоду, после росы и до захода солнца, из прокосов на каждой делянке горстями отбирают траву не менее чем из 10 мест. Отобранный образец помещают в марлевый мешочек и отправляют в свежем виде или же после подсушивания. Для этого мешочки с травой размещают под навесом или в хорошо вентилируемом помещении до тех пор, пока растения не станут на ощупь сухими. Не допускают облучения растений прямыми солнечными лучами.
Сено. Пробы отбирают не менее чем в 10 точках скирды на разных уровнях, начиная с высоты 0,5-1 м. Масса точечной пробы должна составлять 200-250 г. От каждых 5 т заскирдованного сена берут объединенную пробу массой не менее 1 кг. Отбор проб проводят пробоотборниками конструкции ВНИИ кормов имени В. В. Вильмса или ПГК-7 и ПГК-8.
Число точечных проб от партии непрессованного сена массой до 25 т должно быть не менее 20, от каждых последующих 5т – дополнительно еще по 4. Для отбора проб в колхозах и совхозах рекомендуется минимальное число точечных проб, равное 8. В период стойлового содержания скота пробы можно отбирать вручную при вскрытии скирды в процессе погрузки корма на транспорт или на скотном дворе по мере разгрузки корма.
Пробы прессованного сена при отсутствии пробоотборника отбирают в период укладки тюков в штабель: массой до 15 т – в количестве 3 %, но не менее чем из 5 тюков; от 15 до 50 т – 1 %, но не менее чем из 15 тюков. Точечные пробы из прессованного сена берут от каждого отобранного тюка. Для этого с тюка снимают проволоку или шпагат и, не нарушая целостности сена, выбирают но одному пласту: из первого тюка пласт с края, из второго – рядом с крайним, из третьего – следующий пласт и т. д.
Отобранные разовые пробы сена раскладывают на брезенте или пленке размером примерно 2×2 м и осторожно перемешивают, не допуская ломки растений и образования трухи, составляя объединенную пробу. Масса объединенной пробы от партии непрессованного и прессованного сена должна быть не менее 5 кг. Из общей пробы выделяют образец для анализа массой не менее 1 кг. Отобранный образец помещают в пакет из плотной ткани или полиэтилена.
Образцы соломы для ветеринарно-санитарного анализа берут таким же образом.
Силос, сенаж. Пробы отбирают не ранее чем через 1 мес. после закладки на хранение (после окончания процесса консервации) II не менее чем за 10 дн. до скармливания, сдачи или продажи другим хозяйствам. В случае подозрения на отравление животных силосом или сенажом пробы берут немедленно после возникновения таких случаев.
Образцы отбирают из силосных сооружений (башни, траншеи, ямы), заполненных однородным сырьем, при подозрении на отравление – из участков, из которых проводили забор кормов в день возникновения заболевания. Отбор проб осуществляют с помощью пробоотборников различной конструкции.
Точечные пробы отбирают пробоотборником на всю глубину слоя. Верхний слой (порченый), резко отличающийся по цвету от основной массы при отборе проб на качественный анализ силоса, предварительно убирают и в образец не включают, при подозрении на отравление – отбирают отдельно. От каждого хранилища отбирают минимум три пробы.
Рекомендуется точки отбора проб в траншеях с открытыми торцовыми сторонами располагать по диагонали на равных расстояниях друг от друга: одна должна находиться в центре траншеи и две – на концах на 0,5 м от стен (краев) и пять – от торцовых сторон сооружений; в траншеях с боковыми – торцовыми сторонами – на 0,5 м от стен.
Объединенную пробу помещают на пленку или брезент и после тщательного и быстрого перемешивания выбирают из нескольких мест средний образец массой около 1 кг. Средний образец помещают в банки, добавляют смесь хлороформа и толуола (1:1), вносят ее равными частями на дно, к середину емкости и сверху из расчета 5 мл на 1 кг массы, плотно закрывают пробками или крышками. При отсутствии банок допускается использование плотных полиэтиленовых мешочков. Пакет с образцом закрывают, предварительно вытеснив воздух путем сдавливания заполненной части пакета, один мешок вкладывают в другой, этикетку помещают между ними.
Корнеклубнеплоды. Из различных мест подлежащей исследованию партии откладывают без выбора примерно по 10 рядом лежащих корней таким образом, чтобы общая масса 100 отобранных корней составляла около 100 кг. Корни очищают от земли (но не моют) и сортируют на крупные, средние и мелкие. Корнеплоды каждого сорта взвешивают отдельно и рассчитывают их весовое соотношение. Данные записывают в паспорт образца. Из каждого сорта отбирают несколько корнеплодов в качестве среднего образца массой около 5 кг и укладывают в отдельные мешочки. Образец корней различной величины нумеруют одним номером и заносят в один паспорт. При отправке в лабораторию эти мешочки упаковывают в общий мешок или ящик. Таким образом готовят образцы свеклы, брюквы, турнепса, моркови.
Картофель отбирают отдельно из каждой емкости хранения. От партии, хранящейся в закромах, буртах, траншеях, средний образец отбирают в каждом хранилище. При хранении картофеля насыпью точечные пробы берут по всей высоте, ширине и длине насыпи из разных мест и слоем через равные расстояния. Число точечных проб отбирают от партии с учетом общей массы. Отдельные точечные пробы должны быть одинаковыми по размеру, но не менее 3 кг, для партии свыше 60 т – не менее 10 кг. В лабораторию на анализ направляют средний образец массой 2-4 кг.
Водянистые корма. Образцы водянистых кормов (барда, пивная дробина, жом свежий и кислый, кормовая патока) берут после тщательного перемешивания в таре.
Отбор точечных проб можно проводить с помощью специального пробоотборника ПВК-1 конструкции НПО «Агроприбор» из разных мест и с разной глубины. Отобранную пробу консервируют смесью хлороформа и толуола или смесью ксилола и толуола (1:1) в количестве 5 мл на 1 кг корма. Консервант с кормом тщательно перемешивают. Можно также использовать 5 %-ный раствор формалина в количестве 3-5 мл на 1 кг корма. Величину среднего образца определяют из такого расчета, чтобы его масса составляла не менее 150 г на сухое вещество.
Зерно. Точечные пробы зерна, хранящегося на складах и. на площадках при высоте насыпи до 1,5 м, отбирают ручным щупом с навинчивающимися штангами. Поверхность насыпи делят на секции (каждая примерно 200 м2). Пробы отбирают в шести точках на расстоянии 1 м от стен склада (края площадки) и границ секции и на одинаковом расстоянии друг от друга по схеме «Г».
При небольших количествах зерна в партии допускается брать точечные пробы в четырех точках поверхности секции площадью до 100 м по схеме «Д». Точечные пробы отбирают из верхнего слоя на глубине 10-15 см от поверхности насыпи, из среднего и нижнего слоев. Общая масса точечных проб должна составлять около 2 кг на каждую секцию.
Из зашитых мешков точечные пробы отбирают мешочным щупом в трех доступных точках мешка. Щуп вводят по направлению к средней части мешка желобком вниз, сдвигая нити мешка. Образовавшееся отверстие заделывают крестообразными движениями острия щупа. Общая масса точечных проб должна быть не менее 2 кг.
Точечные пробы объединяют в чистой, крепкой, не зараженной хлебными вредителями таре, смешивают и образуют объединенную пробу, из которой с помощью делителя или ручным способом выделяют среднюю пробу, масса которой должна быть не менее 2 кг.
Жмыхи. При хранении жмыхов насыпью на площадках или в амбарах поверхность насыпи условно делят на секции площадью 1 м2. Точечные пробы отбирают от секций верхнего, среднего и нижнего слоев по 1,5 кг каждая.
Для составления среднего образца жмыхов, упакованных в мешки, отбирают точечные пробы около 0,5 кг каждая из каждого десятого (иногда пятого) мешка. Из первого мешка пробу берут сверху, из второго – из середины, из третьего – снизу и т. д. Объединенная проба при ручном отборе на каждые 16 т корма должна быть массой не менее 16 кг.
В случае отбора проб жмыха в виде плиток рекомендуется брать 16 плиток на 80 т жмыха, из них выбрать четыре типичные, раздробить их, тщательно перемешать и отобрать 0,6-0,8 кг. После осмотра все пробы жмыхов тщательно перемешивают и получают объединенную пробу, которую раскладывают в виде квадрата слоем 10 см, и после необходимого числа квартований выделяют средний образец массой около 1 кг, который направляют в лабораторию.
Корма животного происхождения. При хранении муки в таре точечные пробы берут чистым сухим щупом по диагонали от 10 % мест всей партии, но не менее чем из трех, массой около 1,5 кг. При бестарном хранении точечные пробы отбирают с транспортера через равные промежутки времени в течение непрерывной загрузки партии муки в бункер из расчета 250 г от каждой тонны продукции, но не менее 15 кг от каждой партии. Объединенную пробу тщательно перемешивают и отбирают для отправки в лабораторию образец массой около 1,5 кг.
Кормовые добавки. Отбор средних образцов порошковидных и мелкокристаллических минеральных веществ, карбамида, фосфатных кормовых добавок проводят из разных мест щупом аналогично взятию проб зерновых и мучнистых кормов. Средний образец составляют равным 0,6-0,7 кг.
Комбикорма, мука травяная, мука из древесной зелени, отруби, мучка, сечка, дрожжи кормовые, паприн, эприн и другие белковые корма. На складах, хозяйствах из партий рассыпного и гранулированного комбикорма точечные пробы отбирают вагонным или амбарным щупом, а при его отсутствии совком из центра квадрата площадью 4-5 м2 каждый: при высоте насыпи до 0,75 м – из верхнего и нижнего слоев, свыше 0,75 м – из верхнего, среднего и нижнего. Масса объединенной пробы от партий рассыпного корма должна быть не менее 4 кг, после смешивания и квартования из нее выбирают средний образец для анализа массой 0,5-1 кг.
В спорных случаях отбирают два средних образца с тем, чтобы один оставить для контроля.
При пересылке проб корма, если они влажные, их просушивают при температуре 40-45 0С до воздушно-сухого состояния. Сыпучие корма отправляют в мешочках, а грубые в ящиках или мешках. Сочные и жидкие в стеклянных банках.
На каждую пробу корма посылаемой в лабораторию пишут сопроводительную записку (вид корма или состав корма, когда, кем и откуда взят, причины посылки его на исследования, клинические или патологоанатомические изменения у животных заболевших после поедания посылаемых кормов, условия хранения кормов, почтовый и телеграфный адрес отправителя, номер телефона, дата, время, подпись отправляющего).
Просмотров: 3022
Вернуться в категорию: Животные
Источник
ОКС 65 120
Предисловие
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным учреждением “Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов” (ФГБУ “ВГНКИ”)
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 454 “Охрана жизни и здоровья животных и ветеринарно-санитарная безопасность продуктов животного происхождения и кормов”
3 УТВЕРЖДЕН и ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 июля 2014 г. N 705-ст
4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Февраль 2020 г.
Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. N 162-ФЗ “О стандартизации в Российской Федерации”. Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе “Национальные стандарты”, а официальный текст изменений и поправок – в ежемесячном информационном указателе “Национальные стандарты”. В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя “Национальные стандарты”. Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования – на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на корма, кормовые добавки и сырье для их производства и устанавливает метод идентификации и количественного определения содержания генетически-модифицированной* сои (далее – ГМ сои) и генетически-модифицированной* кукурузы (далее – ГМ кукурузы) методом полимеразной цепной реакции (далее – ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR).
________________
* Текст документа соответствует оригиналу. Здесь и далее. – Примечание изготовителя базы данных.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 31719 Продукты пищевые и корма. Экспресс-метод определения сырьевого состава (молекулярный)
ГОСТ ISO 6497 Корма. Отбор проб
ГОСТ ISO/IEC 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ Р 51848 Продукция комбикормовая. Термины и определения
ГОСТ Р 52173 Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически-модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения
ГОСТ Р 53244 (ИСО 21570:2005) Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически-модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот
ГОСТ Р 55576-2013 Корма и кормовые добавки. Метод качественного определения регуляторных последовательностей в геноме сои и кукурузы
Примечание – При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования – на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю “Национальные стандарты”, который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя “Национальные стандарты” за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены термины, определения и сокращения по ГОСТ ISO 6497, ГОСТ Р 51848, ГОСТ Р 55576 и ГОСТ 31719.
4 Условия выполнения испытаний и требования безопасности
Условия выполнения испытаний и требования безопасности – по ГОСТ Р 55576-2013 (раздел 4, приложение А).
5 Оборудование, материалы и реагенты
5.1 Требования к оборудованию – по ГОСТ Р ISO/IEC 17025.
5.2 При проведении испытаний применяют оборудование и материалы по ГОСТ 31719, а также следующие:
– бокс ламинарный II класса биологической безопасности;
– отсасыватель вакуумный медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости;
– микропробирки одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся вместимостью 1,5 см;
– микропробирки одноразовые полипропиленовые вместимостью 0,2 см;
– ПЦР-бокс;
– прибор для проведения ПЦР;
________________
Прибор для проведения ПЦР “Rotor-Gene” 2000/3000/6000 (“Corbett Research“, Австралия). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.
– халаты медицинские.
Допускается использование другого оборудования и материалов с техническими характеристиками не хуже указанных выше.
5.3 При проведеним испытаний применяют реагенты для экстракции ДНК по ГОСТ Р 55576, а также следующие реагенты, праймеры и зонды для проведения ПЦР и амплификации.
5.3.1 Реагенты:
– вода деионизованная;
– ПЦР-буфер;
– раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) 10 (10-кратная смесь четырех компонентов с концентрацией каждого компонента 1,7610 моль/дм);
– Taq-полимераза термостабильная;
– образцы стандартные состава ГМ сои и ГМ кукурузы, содержащие от 0,1% до 5,0% линий ГМ сои и ГМ кукурузы.
________________
Стандартные образцы состава ГМ сои и ГМ кукурузы “Сигма Алдрич”, CCM от JRC, IRMM. Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.
Допускается использование других реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных выше.
5.3.2 Праймеры (смесь олигонуклеотидов) и зонды (меченные флуоресцентными красителями FAM и R6G):
5.3.2.1 Для определения ГМ сои линии 40-3-2:
а) специфичные целевой последовательности:
1) праймер 1: 5′-GCC ATG TTG TTA ATT TGT GCC AT 3′;
2) праймер 2: 5′-GAA GTT CAT TTC ATT TGG AGA GGA C 3′;
3) зонд: 5′-FAM-CTT GAA AGA TCT GCT AGA GTC AGC TTG TCA GCG – BHQ1-3′;
б) специфичные гену лектина (lec 1):
1) праймер 1: 5′-TCC ACC CCC ATC CAC ATT T-3′;
2) праймер 2: 5′-GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA-3′;
3) зонд: 5′-R6G-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-BHQ1-3′;
5.3.2.2 Для определения ГМ сои линии А2704-12:
а) специфичные целевой последовательности:
1) праймер 1: 5′-GCA AAA AAG CGG TTA GCT CCT-3′;
2) праймер 2: 5′-ATT CAG GCT GCG CAA CTG TT-3′;
3) зонд: 5′-FAM-CGG TCC TCC GAT CGC CCT TCC-BHQ1-3′;
б) специфичные гену лектина (lec 2):
1) праймер 1: 5′-CAC CTT TCT CGC ACC AAT TGA CA-3′;
2) праймер 2: 5′-TCA AAC TCA ACA GCG ACG AC-3′;
3) зонд: 5′-P6G-CCA CAA ACA CAT GCA GGT TAT CTT GG-BHQ1-3′;
5.3.2.3 Для определения ГМ сои линии А5547-127:
а) специфичные целевой последовательности:
1) праймер 1: 5′- GCT ATT TGG TGG CAT TTT TCC A 3′;
2) праймер 2: 5′-CAC TGC GGC CAA CTT ACT TCT 3′;
3) зонд: 5′-FAM-CC GCA ATG TCA TAC CGT CAT CGT TGT-BHQ1-3′;
б) специфичные гену лектина (lec 3):
1) праймер 1: 5′-CCT TCT CGC ACC AAT TGA CA-3′;
2) праймер 2: 5′-TCA AAC TCA ACA GCG ACG AC-3′;
3) зонд: 5′-R6G-CC ACA AAC ACA TGC AGG TTA TCT TGG-BHQ1-3′;
5.3.2.4 Для определения ГМ кукурузы линии MON 810:
а) специфичные целевой последовательности:
1) праймер 1: 5′-TCG AAG GAC GAA GGA CTC TAA CGT-3′;
2) праймер 2: 5′-GCC ACC TTC CTT TTC CAC TAT CTT-3′;
3) зонд: 5′-FAM-AAC ATC CTT TGC CAT TGC CCA GC-BHQ1-3′;
б) специфичные гену зеина (hmg):
1) праймер 1: 5′-TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCT GA-3′;
2) праймер 2: 5′-GCT ACA TAG GGA GCC TTG TCC T-3′;
3) зонд: 5′-R6G-CAA TCC ACA CAA ACG CAC GCG TA-BHQ1-3′;
5.3.2.5 Для определения ГМ кукурузы линии NK 603:
а) специфичные целевой последовательности:
1) праймер 1: 5′-ATG AAT GAC CTC GAG TAA GCT TGT TAA-3′;
2) праймер 2: 5′-AAG AGA TAA CAG GAT CCA CTC AAA CAC T-3′;
3) зонд: 5′-FAM-TGG TAC CAC GCG ACA CAC TTC CAC TC-BHQ1-3′;
б) специфичные гену зеина (adhl 1):
1) праймер 1: 5′-CCA GCC TCA TGG CCA AAG-3′;
2) праймер 2: 5′-CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG-3′;
3) зонд: 5′-R6G-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-BHQ1-3′;
5.3.2.6 Для определения ГМ кукурузы линии Bt 11:
а) специфичные целевой последовательности:
1) праймер 1: 5′-GCG GAA CCC CTA TTT GTT TA-3′;
2) праймер 2: 5′-TCC AAG AAT CCC TCC ATG AG-3′;
3) зонд: 5′-FAM-AAA TAC ATT CAA ATA TGT ATC CGC TCA-BHQ1-3′;
б) специфичные гену зеина (adhl 2):
1) праймер 1: 5′-CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC-3′;
2) праймер 2: 5′-CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC-3′;
3) зонд: 5′-R6G-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-BHQ1-3′;
5.3.2.7 Для определения ГМ кукурузы линии T 25:
а) специфичные целевой последовательности:
1) праймер 1: 5′-ACA AGC GTG TCG TGC TCC AC-3′;
2) праймер 2: 5′-GAC ATG ATA CTC CTT CCA CCG-3′;
3) зонд: 5′-FAM-TCA TTG AGT CGT TCC GCC ATT GTC G-BHQ1-3′;
б) специфичные гену зеина (adhl 3):
1) праймер 1: 5′-CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CCT-3′;
2) праймер 2: 5′-CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC-3′;
3) зонд: 5′-R6G-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-BHQ1-3′;
5.3.2.8 Для определения ГМ кукурузы линии GA 21:
а) специфичные целевой последовательности:
1) праймер 1: 5′-CTT ATC GTT ATG CTA TTT GCA ACT TTA GA-3′;
2) праймер 2: 5′-TGG CTC GCG ATC CTC CT-3′;
3) зонд: 5′-FAM-CAT ATA CTA ACT CAT ATC TCT TTC TCA ACA GCA CCT GGG-BHQ1-3′;
б) специфичные гену зеина (adhl 4):
1) праймер 1: 5′-CCA GCC TCA TGG CCA AAG-3′;
2) праймер 2: 5′-CCT TCC TTG GCG GCT TAT CTG-3′;
3) зонд: 5′-R6G-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-BHQ1-3′;
5.3.2.9 Для определения ГМ кукурузы линии MIR 604:
а) специфичные целевой последовательности:
1) праймер 1: 5′-GCG CAC GCA ATT CAA CAG-3′;
2) праймер 2: 5′-GGT CAT AAC GTC ACT CCC TTA ATT CT-3′;
3) зонд: 5′-FAM-AGG CGG GAA ACG ACA ATC TGA TCA TG-BHQ1-3′;
б) специфичные гену зеина (adhl 5):
1) праймер 1: 5′-CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC-3′;
2) праймер 2: 5′-CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC-3′;
3) зонд: 5′-R6G-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-BHQ1-3′;
5.3.2.10 Для определения ГМ кукурузы линии MON 863:
а) специфичные целевой последовательности:
1) праймер 1: 5′-GTA GGA TCG GAA AGC TTG GTA C-3′;
2) праймер 2: 5′-TGT TAC GGC CTA AAT GCT GAA CT-3′;
3) зонд: 5′-FAM-TGA ACA CCC ATC CGA ACA AGT AGG GTC A-BHQ1-3′;
б) специфичные гену зеина (adhl 6):
1) праймер 1: 5′-CCA GCC TCA TGG CCA AAG-3′;
2) праймер 2: 5′-CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG-3′;
3) зонд: 5′-R6G-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-BHQ1-3′.
6 Сущность метода
6.1 Сущность метода идентификации и количественного определения содержания ГМ сои и ГМ кукурузы методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR) заключается в проведении двух независимых ПЦР в одной пробирке с использованием специфичных праймеров и зондов, меченных флуоресцентными красителями, с целью выявления участка эндогенной ДНК, характерной для всех линий ГМ сои или ГМ кукурузы, и участка рекомбинантной ДНК, специфичной для определенных генетических линий.
6.2 Возможно проведение ПЦР в двух пробирках с использованием одного красителя по ГОСТ Р 53244.
7 Отбор проб
Отбор лабораторных проб, подготовка анализируемой пробы, условия хранения и транспортирования – по ГОСТ Р 55576.
8 Экстракция ДНК
Экстракцию ДНК проводят в соответствии с ГОСТ Р 52173 или ГОСТ Р 55576.
9 Постановка ПЦР и проведение амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR)
9.1 Приготовление реакционной ПЦР-смеси
Для приготовления реакционной ПЦР-смеси для определения ГМ сои или ГМ кукурузы берут 1 мм деионизованной воды, по 1 мм каждого праймера 1 по 5.3.2 концентрацией 510 моль/дм, по 1 мм каждого праймера 2 по 5.3.2 концентрацией 510 моль/дм, по 1 мм каждого зонда по 5.3.2 концентрацией 310 моль/дм, 3 мм раствора дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) и смешивают в пробирке вместимостью 1,5 см.
Срок хранения готовой ПЦР-смеси при температуре не выше минус 18°С – не более 12 мес.
9.2 Постановка ПЦР
9.2.1 ДНК, экстрагированную из анализируемой пробы (включая стандартные образцы), испытывают не менее чем в двух повторностях.
9.2.2 Для проведения двух независимых ПЦР в одной пробирке смешивают 10 мм ПЦР-смеси по 9.1, 5 мм ПЦР-буфера и 0,5 ммполимеразы (TaqF). Смесь перемешивают и осаждают на микроцентрифуге-встряхивателе в течение 15-30 с.
9.2.3 В микропробирку вместимостью 0,2 см вносят по 15 мм смеси, полученной по 9.2.2, затем, используя наконечник с аэрозольным барьером, добавляют в нее 10 мм ДНК, полученной экстракцией из анализируемой пробы (ДНК-проба) в соответствии с разделом 8. Общий объем реакции – 25 мм.
9.2.4 Ставят контрольные реакции амплификации:
– отрицательный контрольный образец (К-) – вместо ДНК-пробы вносят в микропробирку со смесью по 9.2.2 10 мм ТЕ-буфера;
– положительный контрольный образец (К+) – вместо ДНК-пробы вносят в микропробирку со смесью по 9.2.2 10 мм 1%-ного стандартного образца состава ГМ сои и ГМ кукурузы.
9.2.5 При каждой постановке ПЦР ставят шесть реакций амплификации со стандартными образцами ГМ сои и ГМ кукурузы для построения калибровочной кривой. Для этого в три микропробирки со смесью по 9.2.2 вносят по 10 мм каждого стандартного образца, содержащего от 0,1% до 5,0% линий ГМ сои и ГМ кукурузы. Реакцию амплификации проводят в двух повторностях.
Примечание – Стандартный образец может иметь любую концентрацию в пределах указанного диапазона.
9.3 Проведение амплификации и детекции флуоресцентного сигнала
Программируют прибор для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
Программа амплификации для количественного определения ГМ сои приведена в таблице 1.
Таблица 1
Стадия амплификации | Программа |
Денатурация первичная | 95°С/5 мин |
45 циклов | 95°С/15 с |
60°С/30 с | |
72°С/30 с |
Детекцию проводят при температуре 60°С по каналам FAM/Green, JOE/Yellow.
Программа амплификации для количественного определения ГМ кукурузы приведена в таблице 2.
Таблица 2
Стадия амплификации | Программа |
Денатурация первичная | 95°С/15 мин |
10 циклов | 95°С/15 с 60°С/20 с 72°С/15 с |
35 циклов | 95°С/15 с 55°С/20 с 72°С/15 с |
Детекцию проводят при температуре 55°С по каналам FAM/Green, JOE/Yellow.
Детекцию флуоресцентного сигнала проводят на каналах FAM и JOE. По каналу FAM регистрируют уровень флуоресценции для генетической линии, по каналу JOE – для эндогенной ДНК ГМ сои или ГМ кукурузы. Кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируют с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме реального времени (Real Time PCR).
Границы интервала, в котором погрешность определения находится с доверительной вероятностью P=0,95, составляют от 0,1% до 5,0%, нижнюю и верхнюю границы погрешности определяют с использованием стандартных образцов.
Стандартное отклонение повторяемости результатов составляет от 0,067 (для 0,1%) до 0,54 (для 5%).
Коэффициент корреляции калибровочной прямой, построенной по стандартным образцам ГМО, >0,97. Если коэффициент корреляции менее 0,97 – требуется повторный анализ всех проб, начиная с этапа амплификации.
9.4 Учет результатов
Учет результатов и расчет содержания ГМ сои или ГМ кукурузы проводят по ГОСТ Р 53244.
9.5 Возможные ошибки
Возможные ошибки – по ГОСТ Р 55576-2013 (подраздел 10.3).
УДК 636.086.15:636.086.006.034 | ОКС 65 120 |
Ключевые слова: корма, кормовые добавки, генетически модифицированные организмы, генетически модифицированная соя, генетически модифицированная кукуруза, полимеразная цепная реакция, гибридизационно-флуоресцентная детекция в режиме реального времени, амплификация, рекомбинантная ДНК, праймеры, зонды |
Электронный текст документа
подготовлен АО “Кодекс” и сверен по:
официальное издание
М.: Стандартинформ, 2020
Источник