Госты на ту корма растительного происхождения
ОКС 65 120
Предисловие
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным учреждением “Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов” (ФГБУ “ВГНКИ”)
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 454 “Охрана жизни и здоровья животных и ветеринарно-санитарная безопасность продуктов животного происхождения и кормов”
3 УТВЕРЖДЕН и ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 июля 2014 г. N 705-ст
4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Февраль 2020 г.
Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. N 162-ФЗ “О стандартизации в Российской Федерации”. Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе “Национальные стандарты”, а официальный текст изменений и поправок – в ежемесячном информационном указателе “Национальные стандарты”. В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя “Национальные стандарты”. Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования – на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на корма, кормовые добавки и сырье для их производства и устанавливает метод идентификации и количественного определения содержания генетически-модифицированной* сои (далее – ГМ сои) и генетически-модифицированной* кукурузы (далее – ГМ кукурузы) методом полимеразной цепной реакции (далее – ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR).
________________
* Текст документа соответствует оригиналу. Здесь и далее. – Примечание изготовителя базы данных.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 31719 Продукты пищевые и корма. Экспресс-метод определения сырьевого состава (молекулярный)
ГОСТ ISO 6497 Корма. Отбор проб
ГОСТ ISO/IEC 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ Р 51848 Продукция комбикормовая. Термины и определения
ГОСТ Р 52173 Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически-модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения
ГОСТ Р 53244 (ИСО 21570:2005) Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически-модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот
ГОСТ Р 55576-2013 Корма и кормовые добавки. Метод качественного определения регуляторных последовательностей в геноме сои и кукурузы
Примечание – При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования – на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю “Национальные стандарты”, который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя “Национальные стандарты” за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены термины, определения и сокращения по ГОСТ ISO 6497, ГОСТ Р 51848, ГОСТ Р 55576 и ГОСТ 31719.
4 Условия выполнения испытаний и требования безопасности
Условия выполнения испытаний и требования безопасности – по ГОСТ Р 55576-2013 (раздел 4, приложение А).
5 Оборудование, материалы и реагенты
5.1 Требования к оборудованию – по ГОСТ Р ISO/IEC 17025.
5.2 При проведении испытаний применяют оборудование и материалы по ГОСТ 31719, а также следующие:
– бокс ламинарный II класса биологической безопасности;
– отсасыватель вакуумный медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости;
– микропробирки одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся вместимостью 1,5 см;
– микропробирки одноразовые полипропиленовые вместимостью 0,2 см;
– ПЦР-бокс;
– прибор для проведения ПЦР;
________________
Прибор для проведения ПЦР “Rotor-Gene” 2000/3000/6000 (“Corbett Research“, Австралия). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.
– халаты медицинские.
Допускается использование другого оборудования и материалов с техническими характеристиками не хуже указанных выше.
5.3 При проведеним испытаний применяют реагенты для экстракции ДНК по ГОСТ Р 55576, а также следующие реагенты, праймеры и зонды для проведения ПЦР и амплификации.
5.3.1 Реагенты:
– вода деионизованная;
– ПЦР-буфер;
– раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) 10 (10-кратная смесь четырех компонентов с концентрацией каждого компонента 1,7610 моль/дм);
– Taq-полимераза термостабильная;
– образцы стандартные состава ГМ сои и ГМ кукурузы, содержащие от 0,1% до 5,0% линий ГМ сои и ГМ кукурузы.
________________
Стандартные образцы состава ГМ сои и ГМ кукурузы “Сигма Алдрич”, CCM от JRC, IRMM. Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.
Допускается использование других реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных выше.
5.3.2 Праймеры (смесь олигонуклеотидов) и зонды (меченные флуоресцентными красителями FAM и R6G):
5.3.2.1 Для определения ГМ сои линии 40-3-2:
а) специфичные целевой последовательности:
1) праймер 1: 5′-GCC ATG TTG TTA ATT TGT GCC AT 3′;
2) праймер 2: 5′-GAA GTT CAT TTC ATT TGG AGA GGA C 3′;
3) зонд: 5′-FAM-CTT GAA AGA TCT GCT AGA GTC AGC TTG TCA GCG – BHQ1-3′;
б) специфичные гену лектина (lec 1):
1) праймер 1: 5′-TCC ACC CCC ATC CAC ATT T-3′;
2) праймер 2: 5′-GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA-3′;
3) зонд: 5′-R6G-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-BHQ1-3′;
5.3.2.2 Для определения ГМ сои линии А2704-12:
а) специфичные целевой последовательности:
1) праймер 1: 5′-GCA AAA AAG CGG TTA GCT CCT-3′;
2) праймер 2: 5′-ATT CAG GCT GCG CAA CTG TT-3′;
3) зонд: 5′-FAM-CGG TCC TCC GAT CGC CCT TCC-BHQ1-3′;
б) специфичные гену лектина (lec 2):
1) праймер 1: 5′-CAC CTT TCT CGC ACC AAT TGA CA-3′;
2) праймер 2: 5′-TCA AAC TCA ACA GCG ACG AC-3′;
3) зонд: 5′-P6G-CCA CAA ACA CAT GCA GGT TAT CTT GG-BHQ1-3′;
5.3.2.3 Для определения ГМ сои линии А5547-127:
а) специфичные целевой последовательности:
1) праймер 1: 5′- GCT ATT TGG TGG CAT TTT TCC A 3′;
2) праймер 2: 5′-CAC TGC GGC CAA CTT ACT TCT 3′;
3) зонд: 5′-FAM-CC GCA ATG TCA TAC CGT CAT CGT TGT-BHQ1-3′;
б) специфичные гену лектина (lec 3):
1) праймер 1: 5′-CCT TCT CGC ACC AAT TGA CA-3′;
2) праймер 2: 5′-TCA AAC TCA ACA GCG ACG AC-3′;
3) зонд: 5′-R6G-CC ACA AAC ACA TGC AGG TTA TCT TGG-BHQ1-3′;
5.3.2.4 Для определения ГМ кукурузы линии MON 810:
а) специфичные целевой последовательности:
1) праймер 1: 5′-TCG AAG GAC GAA GGA CTC TAA CGT-3′;
2) праймер 2: 5′-GCC ACC TTC CTT TTC CAC TAT CTT-3′;
3) зонд: 5′-FAM-AAC ATC CTT TGC CAT TGC CCA GC-BHQ1-3′;
б) специфичные гену зеина (hmg):
1) праймер 1: 5′-TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCT GA-3′;
2) праймер 2: 5′-GCT ACA TAG GGA GCC TTG TCC T-3′;
3) зонд: 5′-R6G-CAA TCC ACA CAA ACG CAC GCG TA-BHQ1-3′;
5.3.2.5 Для определения ГМ кукурузы линии NK 603:
а) специфичные целевой последовательности:
1) праймер 1: 5′-ATG AAT GAC CTC GAG TAA GCT TGT TAA-3′;
2) праймер 2: 5′-AAG AGA TAA CAG GAT CCA CTC AAA CAC T-3′;
3) зонд: 5′-FAM-TGG TAC CAC GCG ACA CAC TTC CAC TC-BHQ1-3′;
б) специфичные гену зеина (adhl 1):
1) праймер 1: 5′-CCA GCC TCA TGG CCA AAG-3′;
2) праймер 2: 5′-CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG-3′;
3) зонд: 5′-R6G-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-BHQ1-3′;
5.3.2.6 Для определения ГМ кукурузы линии Bt 11:
а) специфичные целевой последовательности:
1) праймер 1: 5′-GCG GAA CCC CTA TTT GTT TA-3′;
2) праймер 2: 5′-TCC AAG AAT CCC TCC ATG AG-3′;
3) зонд: 5′-FAM-AAA TAC ATT CAA ATA TGT ATC CGC TCA-BHQ1-3′;
б) специфичные гену зеина (adhl 2):
1) праймер 1: 5′-CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC-3′;
2) праймер 2: 5′-CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC-3′;
3) зонд: 5′-R6G-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-BHQ1-3′;
5.3.2.7 Для определения ГМ кукурузы линии T 25:
а) специфичные целевой последовательности:
1) праймер 1: 5′-ACA AGC GTG TCG TGC TCC AC-3′;
2) праймер 2: 5′-GAC ATG ATA CTC CTT CCA CCG-3′;
3) зонд: 5′-FAM-TCA TTG AGT CGT TCC GCC ATT GTC G-BHQ1-3′;
б) специфичные гену зеина (adhl 3):
1) праймер 1: 5′-CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CCT-3′;
2) праймер 2: 5′-CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC-3′;
3) зонд: 5′-R6G-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-BHQ1-3′;
5.3.2.8 Для определения ГМ кукурузы линии GA 21:
а) специфичные целевой последовательности:
1) праймер 1: 5′-CTT ATC GTT ATG CTA TTT GCA ACT TTA GA-3′;
2) праймер 2: 5′-TGG CTC GCG ATC CTC CT-3′;
3) зонд: 5′-FAM-CAT ATA CTA ACT CAT ATC TCT TTC TCA ACA GCA CCT GGG-BHQ1-3′;
б) специфичные гену зеина (adhl 4):
1) праймер 1: 5′-CCA GCC TCA TGG CCA AAG-3′;
2) праймер 2: 5′-CCT TCC TTG GCG GCT TAT CTG-3′;
3) зонд: 5′-R6G-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-BHQ1-3′;
5.3.2.9 Для определения ГМ кукурузы линии MIR 604:
а) специфичные целевой последовательности:
1) праймер 1: 5′-GCG CAC GCA ATT CAA CAG-3′;
2) праймер 2: 5′-GGT CAT AAC GTC ACT CCC TTA ATT CT-3′;
3) зонд: 5′-FAM-AGG CGG GAA ACG ACA ATC TGA TCA TG-BHQ1-3′;
б) специфичные гену зеина (adhl 5):
1) праймер 1: 5′-CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC-3′;
2) праймер 2: 5′-CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC-3′;
3) зонд: 5′-R6G-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-BHQ1-3′;
5.3.2.10 Для определения ГМ кукурузы линии MON 863:
а) специфичные целевой последовательности:
1) праймер 1: 5′-GTA GGA TCG GAA AGC TTG GTA C-3′;
2) праймер 2: 5′-TGT TAC GGC CTA AAT GCT GAA CT-3′;
3) зонд: 5′-FAM-TGA ACA CCC ATC CGA ACA AGT AGG GTC A-BHQ1-3′;
б) специфичные гену зеина (adhl 6):
1) праймер 1: 5′-CCA GCC TCA TGG CCA AAG-3′;
2) праймер 2: 5′-CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG-3′;
3) зонд: 5′-R6G-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-BHQ1-3′.
6 Сущность метода
6.1 Сущность метода идентификации и количественного определения содержания ГМ сои и ГМ кукурузы методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR) заключается в проведении двух независимых ПЦР в одной пробирке с использованием специфичных праймеров и зондов, меченных флуоресцентными красителями, с целью выявления участка эндогенной ДНК, характерной для всех линий ГМ сои или ГМ кукурузы, и участка рекомбинантной ДНК, специфичной для определенных генетических линий.
6.2 Возможно проведение ПЦР в двух пробирках с использованием одного красителя по ГОСТ Р 53244.
7 Отбор проб
Отбор лабораторных проб, подготовка анализируемой пробы, условия хранения и транспортирования – по ГОСТ Р 55576.
8 Экстракция ДНК
Экстракцию ДНК проводят в соответствии с ГОСТ Р 52173 или ГОСТ Р 55576.
9 Постановка ПЦР и проведение амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR)
9.1 Приготовление реакционной ПЦР-смеси
Для приготовления реакционной ПЦР-смеси для определения ГМ сои или ГМ кукурузы берут 1 мм деионизованной воды, по 1 мм каждого праймера 1 по 5.3.2 концентрацией 510 моль/дм, по 1 мм каждого праймера 2 по 5.3.2 концентрацией 510 моль/дм, по 1 мм каждого зонда по 5.3.2 концентрацией 310 моль/дм, 3 мм раствора дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) и смешивают в пробирке вместимостью 1,5 см.
Срок хранения готовой ПЦР-смеси при температуре не выше минус 18°С – не более 12 мес.
9.2 Постановка ПЦР
9.2.1 ДНК, экстрагированную из анализируемой пробы (включая стандартные образцы), испытывают не менее чем в двух повторностях.
9.2.2 Для проведения двух независимых ПЦР в одной пробирке смешивают 10 мм ПЦР-смеси по 9.1, 5 мм ПЦР-буфера и 0,5 ммполимеразы (TaqF). Смесь перемешивают и осаждают на микроцентрифуге-встряхивателе в течение 15-30 с.
9.2.3 В микропробирку вместимостью 0,2 см вносят по 15 мм смеси, полученной по 9.2.2, затем, используя наконечник с аэрозольным барьером, добавляют в нее 10 мм ДНК, полученной экстракцией из анализируемой пробы (ДНК-проба) в соответствии с разделом 8. Общий объем реакции – 25 мм.
9.2.4 Ставят контрольные реакции амплификации:
– отрицательный контрольный образец (К-) – вместо ДНК-пробы вносят в микропробирку со смесью по 9.2.2 10 мм ТЕ-буфера;
– положительный контрольный образец (К+) – вместо ДНК-пробы вносят в микропробирку со смесью по 9.2.2 10 мм 1%-ного стандартного образца состава ГМ сои и ГМ кукурузы.
9.2.5 При каждой постановке ПЦР ставят шесть реакций амплификации со стандартными образцами ГМ сои и ГМ кукурузы для построения калибровочной кривой. Для этого в три микропробирки со смесью по 9.2.2 вносят по 10 мм каждого стандартного образца, содержащего от 0,1% до 5,0% линий ГМ сои и ГМ кукурузы. Реакцию амплификации проводят в двух повторностях.
Примечание – Стандартный образец может иметь любую концентрацию в пределах указанного диапазона.
9.3 Проведение амплификации и детекции флуоресцентного сигнала
Программируют прибор для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
Программа амплификации для количественного определения ГМ сои приведена в таблице 1.
Таблица 1
Стадия амплификации | Программа |
Денатурация первичная | 95°С/5 мин |
45 циклов | 95°С/15 с |
60°С/30 с | |
72°С/30 с |
Детекцию проводят при температуре 60°С по каналам FAM/Green, JOE/Yellow.
Программа амплификации для количественного определения ГМ кукурузы приведена в таблице 2.
Таблица 2
Стадия амплификации | Программа |
Денатурация первичная | 95°С/15 мин |
10 циклов | 95°С/15 с 60°С/20 с 72°С/15 с |
35 циклов | 95°С/15 с 55°С/20 с 72°С/15 с |
Детекцию проводят при температуре 55°С по каналам FAM/Green, JOE/Yellow.
Детекцию флуоресцентного сигнала проводят на каналах FAM и JOE. По каналу FAM регистрируют уровень флуоресценции для генетической линии, по каналу JOE – для эндогенной ДНК ГМ сои или ГМ кукурузы. Кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируют с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме реального времени (Real Time PCR).
Границы интервала, в котором погрешность определения находится с доверительной вероятностью P=0,95, составляют от 0,1% до 5,0%, нижнюю и верхнюю границы погрешности определяют с использованием стандартных образцов.
Стандартное отклонение повторяемости результатов составляет от 0,067 (для 0,1%) до 0,54 (для 5%).
Коэффициент корреляции калибровочной прямой, построенной по стандартным образцам ГМО, >0,97. Если коэффициент корреляции менее 0,97 – требуется повторный анализ всех проб, начиная с этапа амплификации.
9.4 Учет результатов
Учет результатов и расчет содержания ГМ сои или ГМ кукурузы проводят по ГОСТ Р 53244.
9.5 Возможные ошибки
Возможные ошибки – по ГОСТ Р 55576-2013 (подраздел 10.3).
УДК 636.086.15:636.086.006.034 | ОКС 65 120 |
Ключевые слова: корма, кормовые добавки, генетически модифицированные организмы, генетически модифицированная соя, генетически модифицированная кукуруза, полимеразная цепная реакция, гибридизационно-флуоресцентная детекция в режиме реального времени, амплификация, рекомбинантная ДНК, праймеры, зонды | |
Электронный текст документа
подготовлен АО “Кодекс” и сверен по:
официальное издание
М.: Стандартинформ, 2020
Источник
ГОСТ 32040-2012
Группа С19
МКС 65.120
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 “Межгосударственная система стандартизации. Основные положения” и ГОСТ 1.2-2009 “Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены”
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Открытым акционерным обществом “Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности” (ОАО “ВНИИКП”)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 004)
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 3 декабря 2012 г. N 54-П)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
Армения | AM | Минэкономики Республики Армения |
Беларусь | BY | Госстандарт Республики Беларусь |
Киргизия | KG | Кыргызстандарт |
Молдова | MD | Молдова-Стандарт |
Россия | RU | Росстандарт |
Узбекистан | UZ | Узстандарт |
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 июня 2013 г. N 302-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32040-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2014 г.
5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе “Национальные стандарты”, а текст изменений и поправок – в ежемесячном информационном указателе “Национальные стандарты”. В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе “Национальные стандарты”. Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования – на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на все виды растительных кормов, комбикорма и комбикормовое сырье и устанавливает метод определения содержания сырого протеина, сырой клетчатки, сырого жира и влаги с применением спектроскопии в ближней инфракрасной области.
Настоящий стандарт не распространяется на корма минерального происхождения, жмыхи и шроты.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.2.007.0-75 Система стандартов безопасности труда. Изделия электротехнические. Общие требования безопасности
ГОСТ 7631-2008 Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Методы определения органолептических и физических показателей
ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб
ГОСТ 13496.2-91 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Метод определения сырой клетчатки
ГОСТ 13496.3-92 Комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения влаги
ГОСТ 13496.4-93 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения содержания азота и сырого протеина
ГОСТ 13496.15-97 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения содержания сырого жира
ГОСТ 13586.3-83 Зерно. Правила приемки и методы отбора проб
ГОСТ 17681-82 Мука животного происхождения. Методы испытаний
ГОСТ 20083-74 Дрожжи кормовые. Технические условия
ГОСТ 27262-87 Корма растительного происхождения. Методы отбора проб
ГОСТ 27668-88 Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб
ГОСТ 31218-2003* (ИСО 6498:1998) Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Подготовка испытуемых проб
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51419-99, здесь и далее по тексту. – Примечание изготовителя базы данных.
Примечание – При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования – на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю “Национальные стандарты”, который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя “Национальные стандарты” за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1. Сырой протеин: Суммарное содержание всех азотистых веществ пробы, определяемое по количеству общего азота, умноженному на коэффициент 6,25.
3.2 Сырая клетчатка: Часть углеводов пробы, из которых состоят стенки клеток комбикормового сырья растительного происхождения.
Примечание – В состав сырой клетчатки входят целлюлоза, пентозаны, гексозаны, инкрустирующие вещества и др.
3.3 Влага: Вода, выделяющаяся из анализируемой пробы при высушивании ее до постоянной массы.
3.4 Сырой жир: Смесь триглицеридов жирных кислот и сопутствующих жироподобных веществ пробы.
Примечание – К сопутствующим веществам относят свободные жирные кислоты, спирты, альдегиды, провитамины, пигменты, эфирные масла и др.
4 Сущность метода
Сущность метода заключается в измерении интенсивности отраженного от анализируемой пробы излучения в ближней инфракрасной области спектра, определении содержания сырого протеина, сырой клетчатки, сырого жира и влаги по градуировочным уравнениям, полученным по результатам измерений интенсивности отраженного излучения от образцов с известными значениями определяемых показателей, установленными стандартными химическими методами.
5 Условия проведения измерений
При подготовке и проведении измерений в помещении лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:
температура окружающей среды | от 15 °С до 30 °С; | ||
относительная влажность воздуха | от 20% до 90%; | ||
напряжение питающей сети | (220±15) В; | ||
частота переменного тока | (50±2) Гц. | ||
6 Средства измерений и вспомогательное оборудование
Используют следующее лабораторное оборудование:
Анализатор инфракрасный (ИК-анализатор) для измерения интенсивности отражения излучения от анализируемой пробы в ближней инфракрасной области (от 800 до 2500 нм) с индикацией результатов на экране персонального компьютера или дисплее прибора.
Емкости стеклянные или пластиковые с герметично закрывающимися крышками вместимостью 200-250 см.
Шпатель.
7 Отбор проб
7.1 Отбор проб – по ГОСТ 7631, ГОСТ 13496.0, ГОСТ 13586.3, ГОСТ 17681, ГОСТ 20083, ГОСТ 27262, ГОСТ 27668.
7.2 Масса лабораторной пробы должна быть не менее 250 г.
8 Подготовка к измерению
8.1 Подготовка проб
Подготовка проб – по ГОСТ 31218.
Необходимо точно соблюдать методику измельчения проб, так как размер частиц существенно влияет на результат измерений.
Измельченную анализируемую пробу переносят в плотно закрывающуюся емкость и, после ее охлаждения до комнатной температуры, используют для снятия спектра. При необходимости анализируемую пробу хранят в герметично закрытой стеклянной или пластиковой емкости в сухом темном месте в течение рекомендуемого срока хранения для исследуемого продукта. Анализируемые пробы муки животного происхождения, кормовой муки из рыбы и морепродуктов, травяной муки, а также комбикормов с высоким содержанием этих видов сырья хранят в холодильнике.
8.2 Подготовка ИК-анализатора к работе
Прибор включают и выводят на режим измерений в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
Перед проведением измерений поверхность измерительной кюветы или защитного стекла интегрирующей сферы прибора необходимо очистить.
8.3 Градуировка ИК-анализатора
8.3.1 Градуировку начинают с подготовки двух наборов образцов: основного градуировочного и дополнительного (для проверки градуировки).
Градуировочные наборы образцов для каждого вида сырья и комбикормов готовят отдельно.
Градуировочные образцы подбирают так, чтобы они были представительны по отношению к тем пробам, которые будут затем анализировать с использованием полученных градуировочных уравнений.
Градуировочные образцы должны полностью охватывать весь диапазон возможных значений определяемых показателей и равномерно по нему распределяться, а также обязательно охватывать весь диапазон возможного содержания влаги в анализируемых пробах.
8.3.1.1 Количество проб для получения градуировочного уравнения, предназначенного для анализа образцов с неоднородным видовым составом и различной технологией производства, должно быть не менее 90, для испытания более однородных образцов можно использовать меньшее количество проб. Но во всех случаях количество проб должно быть достаточным для получения градуировочного уравнения, отвечающего требованиям 8.3.6 и раздела 11 настоящего стандарта.
8.3.1.2 Образцы для проверки градуировочного уравнения не должны входить в основной набор градуировочных образцов. Количество образцов для проверки градуировочного уравнения должно быть не менее 10.
Подготовка и анализ проверочных образцов проводятся в тех же условиях, которые использовались для градуировки.
8.3.2 Градуировочные образцы должны быть проанализированы стандартными химическими методами: определение содержания сырого протеина – по ГОСТ 13496.4, сырой клетчатки – по ГОСТ 13496.2, сырого жира – по ГОСТ 13496.15, влаги – по ГОСТ 13496.3.
Анализы выполняют в двух параллельных определениях. При этом обязательно осуществляют контроль точности результатов в соответствии с требованиями стандартов. В случае если такие требования не удовлетворяются, результат отбрасывают и анализы повторяют. Для расчета уравнений берут среднее арифметические значения результатов анализов.
8.3.3 Снятие спектров градуировочных образцов проводят согласно инструкции к прибору. При этом особое внимание уделяют чистоте оптики, встроенного стандарта и измерительной кюветы. Кювету тщательно очищают перед каждым измерением.
Процесс снятия спектров заключается в следующем: тщательно очищенную кювету на специальной подставке, входящей в комплект ИК-анализатора, с помощью шпателя плотно заполняют тщательно перемешанной анализируемой пробой. Избегают резких движений с заполненной кюветой и ее встряхивания. Не допускается насыпать анализируемую пробу из сосуда, так как это приводит к гравитационному разделению фракций и уменьшает точность определения. Измерения выполняют сразу после заполнения кюветы. Каждую порцию анализируемой пробы загружают в прибор для измерений однократно.
8.3.4 Результаты химических испытаний вводят в компьютер в расчете на абсолютно сухое или воздушно-сухое вещество. Полученные результаты также будут представлены в расчете на абсолютно сухое вещество или на воздушно-сухое вещество соответственно.
8.3.5 Расчет градуировочных уравнений проводят в соответствии с инструкцией к ИК-анализатору. При этом данные, значительно отклоняющиеся от линии регрессии и выделенные программой, должны быть исключены из расчетов после выявления причин отклонения. Причинами могут быть ошибки при выполнении химических анализов, при введении данных в компьютер, при снятии спектров. При исключении этих ошибок причиной может быть отличие спектров таких образцов от основной партии. В таком случае в основную партию включают дополнительно не менее 20 подобных образцов.
Полученное при дальнейшем расчете уравнение должно удовлетворять требованиям 8.3.6 и раздела 11. В противном случае такие образцы исключают из градуировочного набора и из них формируют новый набор образцов для расчета соответствующего ему градуировочного уравнения.
Однократно выполненная градуировка применима до тех пор, пока она по точности удовлетворяет требованиям 8.3.6 и раздела 11.
8.3.6 Проверка правильности градуировки. Проверку правильности градуировки проводят непосредственно после выполнения градуировки, а в дальнейшем – не реже 1 раза в год по образцам, подготовленным по 8.3.1.2.
Рассчитывают расхождение между значениями показателей, полученными на ИК-анализаторе и стандартным химическим методом. Среднее значение отклонения, , %, вычисляют по формуле:
, (1)
где – значение показателя, полученное на ИК-анализаторе, %;
– значение показателя, полученное стандартным химическим методом, %;
– количество образцов, использованных для проверки градуировки.
Значение не должно превышать предела воспроизводимости стандартного химического метода.
Если это условие не соблюдается, то увеличивают количество градуировочных образцов или градуировку выполняют заново.
Если градуировочное уравнение признано неприемлемым, необходимо выявить причины, проанализировать их и исправить. Причинами могут быть случайные ошибки при выполнении испытания стандартным химическим методом и недостаточное количество представительных градуировочных образцов для конкретного показателя.
8.3.7 Градуировочное уравнение, полученное на одном приборе, может быть использовано для испытаний на других приборах той же модели после его оценки и корректировки.
Для этого набор из не менее 20 образцов, не использованных при градуировке, подбирают в соответствии с 8.3.1, готовят и анализируют аналогично градуировочным образцам (8.3.2, 8.3.3).
После выполнения всех испытаний сравнивают результаты, полученные стандартным химическим методом и на ИК-анализаторе, определяя среднюю разность (смещение), , по формуле
, (2)
где – число анализируемых проб;
– разность между результатами исследования -го образца инфракрасным и стандартным химическим методами, .
После этого вносят поправку на смещение, вычитая среднюю разность из свободного члена градуировочного уравнения.
Для оценки точности анализов определяют среднеквадратическое отклонение разностей между результатами, полученными на ИК-анализаторе и химическим методом, , после внесения поправки на смещение по формуле
, (3)
где – число анализируемых проб;
– разность между результатами анализов -го образца на ИК-анализаторе и стандартным химическим методом, ;
– средняя разность (смещение).
Если сравнивают результаты анализов одного набора из 20 образцов, то среднеквадратическое отклонение не должно превышать 1,0% для сырого протеина, 2,0% для сырой клетчатки, 0,5% для сырого жира и 0,3% для влаги.
Если сравниваются результаты для большего количества образцов, указанные значения снижаются на 1/4 (например, для сырого протеина будет около 0,8%).
Если точность полученных результатов выходит за указанные пределы, вычисляют уравнение регрессии между результатами, полученными стандартным химическим методом и на ИК-анализаторе
, (4)
где – результат анализа -го образца стандартным химическим методом;
и – постоянные известные величины уравнения;
– результат анализа -го образца на ИК-анализаторе.
Затем вносят поправку в градуировочное уравнение, умножая все его коэффициенты, включая свободный член уравнения, на величину и прибавляя величину к свободному члену уравнения. Используя исправленное уравнение, вновь проводят его проверку.
Если при этом среднеквадратическое отклонение выходит за указанные пределы, градуировку проводят заново.
9 Выполнение измерений
Выполнение измерений инфракрасным методом заключается в снятии спектра анализируемой пробы. Снятие спектров анализируемых проб проводят согласно инструкции к прибору. При этом особое внимание уделяют чистоте оптики, встроенного стандарта и измерительной кюветы.
Заполнение кюветы анализируемой пробой проводят по 8.3.3. Пробу необходимо помещать в измерительную кювету так, как это делалось при снятии спектров градуировочных образцов – плотность загрузки пробы в кювету оказывает большое влияние на интенсивность инфракрасных спектров.
10 Обработка результатов
Обработка результатов измерений производится автоматически. Содержание определяемых показателей считывается с дисплея ИК-анализатора и может быть выведено на печать.
За окончательный результат определения принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости и удовлетворяющих условию приемлемости 11.1 настоящего стандарта.
Полученный результат округляют до первого десятичного знака.
11 Контроль точности результатов измерений
11.1 Приемлемость результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (сходимости)
Абсолютное расхождение между результатами двух параллельных определений, полученными одним и тем же методом на одной лабораторной пробе в одной и той же лаборатории одним и тем же оператором на одном и том же экземпляре оборудования в течение короткого промежутка времени при доверительной вероятности 0,95, не должно превышать предела повторяемости (сходимости), г, приведенного в таблице 1.
Таблица 1
В процентах
Наименование показателя | Допускаемое расхождение между результатами двух параллельных определений (предел повторяемости), <  |